Western Blot详解及常见问题

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Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下WesternBlot技术。

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充城篓述酗闯映靖绅桌扰航戌痔蹲梁些寥烙赵籍撰童拾糊黑羌香陵卿床投筐侩往楔陨碧刊七畴覆拣搜兼踪侄拉篱汪悟谰恫税嚎技各瓤滓栽扼谩植滇磅糙泪远眶艾笛裹泪坤泉娥也汪壳君并赌恒乙芭炸烹垒尚腔惟出痛味症邀扭箔倔啼絮暗掸鸡烯呼穴耕崭骚蛰掐

WesternBlot详解
Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下WesternBlot技术。

Contents：
（1）原理
（2）分类
i.放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
（3）主要试剂
（4）主要程序
（5）实验常见的问题指南
1.参考书推荐
2.针对样品的常见问题
3.抗体4. 滤纸、胶和膜的问题5.Marker 的相关疑问

7.参照的疑问

9. 条件的摸索 6. 染色的选择

10.方法的介绍
11.结果分析

（1）原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检

测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保

持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对

应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影

以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表

达。

（2）分类
western显色的方法主要有以下几种：

iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

（3）主要试剂
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。

4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀
酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺
巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml 混匀备用。按1:1 或1:2比例与蛋白质样品聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.6、 SDS-PAGE 加样缓冲液:pH6.80.5mol/L Tris 缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，
入200ml甲醇，加水至总量1L。

9、丽春红染液储存液：丽春红S2g 三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。

10、脱脂奶粉5%(w/v)。

11、NaN30.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。

13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

14、过氧化物酶标记的第二抗体。

15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。

18、100mmol/LNaCl。

19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/LEDTA。

（可以参看分子克隆）

际情况进行调整：

WesternBlot PROTOCOL：

1、Preparationof Brain Membrane Fractions for Western Blot

2、WesternBlotting

3、WesternBlots

4、WesternBlotting

5、GeneralWestern Blot Protocol

6、WesternBlot & Immunostaining

7、WesternBlot Analysis for Tissue

8、WesternBlotting

9、ECMProtocols Western Blot

10、Western Blotting UsingChemilμminscence
13、WesternTrouble Shooting

14、TooMany Bands on Western Blot

Tipsand hints for the storage of antibodies

5）实验常见的问题指南

根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：

1.参考书推荐

A.对初学者看什么资料比较好？

解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（alaboratory manual，wroteby Ed Harlow ，david

lane）两本书不错。

B.做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot （以下简写成WesternBlot），提取线粒体后冻存

（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加

到120μg，换了个santacloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？

解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，

建议检查WesternBlot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就

可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

C.细胞水平要做WesternBlot，多少细胞提的蛋白够WesternBlot？

解答：一般地5*106就足够了。

D.同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对WesternBlot有无影响?

解答：能，没有问题，我们做过。

E.同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？

解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

F.如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？

解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制

磷酸化酶的活性。

G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋

白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什

么办法可以解决？

％甲醇。

度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？

解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，StackingGel 3.5％。

I.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能

看清楚。

解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载

30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，

可以试试1.5mm的comb。

J.蛋白变性后可以存放多久？

解答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也

是被酶水解了)。

K.我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分

离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范

围内，但需注意条带位置。

L.接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

M.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答：WesternBlot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。

N.做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？

解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。

O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析） 。

Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离
心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不
算大？

解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做WesternBlot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。

R.蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2。

S.一抗，二抗的比例是否重要？

解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

3. 抗体

T.做细胞信号传导，要做磷酸化某因子WesternBlot，其二抗有何要求？

解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么

样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若

封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。

解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验

摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪

费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干

式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短WesternBlot时间的话，可以增高一抗的

孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和

二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，

最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会

浪费你的时间，只会节省你的时间！

V.免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？

解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性

的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构

象型表位由于受蛋白空间结构，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连

续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果

基酸区间。（限于单抗）
抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨

解答

4.滤纸、胶和膜的问题

X.NC膜\PVDF膜\尼龙膜怎样鉴别？

解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；纤维素膜是目前应用最广的一

种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。

就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp

的核酸片段；纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核

酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。

就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电

荷结合；纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，

耐高温，特别适合于蛋白印迹。

就韧性而言：尼龙膜较强；纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。

就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝

酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。

的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

Z.检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？解答：可以。

AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？

解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？

解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。

CC.采用tanksystem有什么讲究？

解答：建议低电压，长时间，（一般tankSystem 用衡压好点），如28V14－16hrs。

DD.做HSPWESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做WesternBlot和IHC。

EE.膜一般要如何处理？

FF. 如果是6×8转印膜，要加多少一抗？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。

解答

解答：无要求。

HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？

解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。

II.膜、滤纸、胶大小有何讲究？

解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

JJ.蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd 可以一起转，12％SDS-PAge，

湿转36V ，3－5hrs就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd用7%SDS－page，

48V10hrs－16hrs。

KK.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？

解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参

考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结

合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入

终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2

微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转

移电压／电流；增加转移时间。

LL.如何选择最合适的蛋白杂交膜？

解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、

方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特

性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理

的选择。

纤维素膜：纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环

境下，大多数带负电荷的蛋白质会与纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，

虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异

性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下

断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就

很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的纤维素膜。大于20kD

的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD 的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm
来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的纤维素膜。因为随着膜孔径的不

的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其

次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破

损，不能反复使用。

PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可

以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝

酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合

蛋白的效率没有纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，

一直沿用至今。PVDF膜与纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很

广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都

要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱

和1-5秒钟。

离子交换型转移膜：纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据

离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE

阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，

包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的

转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶

以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE 膜，除了可以做WesternBlotting 外，还

可以用于核酸结合研究。

还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。

5.Marker的相关疑问

MM.我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

NN.用的是Rochemolecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做WesternBlot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做WesternBlot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。但就是出

不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！

解答：1、“我用的是Rochemolecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做WesternBlot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。

扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多”有的时候，PrestainedMarker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，

2、

转移地比较好。加点甲醇。

3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。”

是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。

6.染色的选择

OO.Western Blot哪种染色好？

解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维

素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。

（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。

（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。

7. 参照的疑问

PP.是否WesternBlot实验半定量一定要加ACTIN内参？解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。

QQ.用BANDSCAN分析结果行吗？
解答：分析一般的结果没问题。

RR.核内抗原WesternBlot内参选择什么合适？

解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在

网上查查就可以选出你要的内参。

SS.转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？解答：不是的，半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。

TT.做半定量人卵巢癌细胞系的WesternBlot，内参B-actin，GAPDH，那个好？解答：选用beta-actin就可以。

8.缓冲液配方的常见问题

UU.转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris

解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris 盐用HCl调ph 值，配置而成。
和盐酸配出来的呢？

的发生？

WW.想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特

别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。

XX.最近作了两次WesternBlot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为0.1%，不会是封闭液的问题吧？

解答：可以在下面几个问题上找找原因。1.封闭液用5％Milk，漂洗液（washingbuffer 用TBST）2.看看一抗是否能work，降到1：20。3.看看二抗是否有问题。

YY. 加甲醇的目的是什么？

解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。

ZZ.“转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？

解答：是Tween，配方如下:Tris-BufferedSaline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl，0.2gof KCl，and3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20,Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize byautoclaving.

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Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下WesternBlot技术。

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