SSH protocol

1 PolyA+mRNA的分离纯化
PolyA+mRNA的分离纯化采用OligotexTMmRNA试剂盒(Qiagen公司)，首先确定总RNA的数量(OD260×40?g/mL×稀释倍数×v)在250～500?g之间，加无RNase的水至总体积为500?L，然后再加入500?L的BuferOBB和30?L的Oligotex悬液，通过吹打或轻弹使其充分混合。在基因扩增仪上，70℃温浴样品3min,(此时洗脱缓冲液OEB可一起预热)然后从水浴中将样品取出，室温(20--30℃)放置10m in。最大转速(14000g )离心2min，使Oligotex:mRNA的复合物沉淀，然后仔细的除去上清液。保存上清液直到得到满意的结果。用400?L的洗涤缓冲液OW2通过涡旋振荡或吹打重悬Oligotex:mRNA沉淀，将重悬的样品加入到Smallspin column(置于1.5mL的离心管上)中，14000g 离心1min，然后将smallspin column转移到一新的1.5mL的无RNase的微量离心管中，再加入400?L的洗涤缓冲液OW2于smallspin cloumn,混匀，14000g 离心1min。转移smallspin column到一新的无RNase的1.5mL的微量离心管中;取15?L洗脱缓冲液OEB重悬Oligotex,140 00g 离心1min。将甩下的洗脱缓冲液OEB再重悬Oligotex,最高速离心，然后将甩下的洗脱缓

mRNA，最后几管测吸光值，看是否洗脱干净。
冲液OEB转移至0.5mL的离心管(无RNase)中，体积约10?L左右。重复洗脱三次，共计回收4管

1抑制消减杂交(suppressionsubtractive hybridization, SSH )
采用Clontech公司的ClontechPCR-SelectTMcDNA消减试剂盒进行抑制消减杂交，以 的

的mRNA(2 ?g )为驱动方(driver)，同时进行反向消减杂交。

dNTPmix (10 mM each) 1.6?L 20×Second-strand enzyme cocktail 4.0?L 总体积 70?L 2、加入上述试剂后将其充分混匀并稍微离心，最终体积为80?L。3、然后置于16℃基因扩增仪上或水浴中温浴反应2h。

4、反应结束后向管内加入2?L (6 units)的T4DNA聚合酶，充分混匀。5、16℃温浴(水浴或基因扩增仪)30min。

6、然后加入4?L的20×EDTA/Glycogen混合物以终止第二链的合成。7、向离心管中加入100?L的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)。

8、通过涡旋振荡充分混合，在室温下14000 g离心10min。

9、仔细将上清夜转移于无菌的0.5mL微量离心管中。

10、然后向上清夜中加入100?L氯仿:异戊醇(24:1)。

12、加40 ?L 的4M 醋酸铵和300 ?L的95%乙醇.
11、涡旋混合，室温下14000 g 离心l0min。将上层液体转移到另一干净的0.5mL 离心管中。

14、仔细的移去上层液体。16、室温下14 000 g 离心10min。

17、去除上清液。

18、空气中干燥沉淀10min除去剩余的乙醇。

19、将沉淀溶于50?L的无核酸酶水中。

20、转移6?L到新的微量离心管中，在-20℃下保存，用RsaI消化后用于琼脂糖凝胶电泳，估计双链cDNA合成的产量和长度范围。

三、Rsa I 消化
将实验组和驱动方的双链cDNA以Rsal四碱基识别酶酶切，产生了更多具有
同源性的较短的平头末端序列，消除了长链cDNA片段形成的复杂结构对消减杂
交的影响，而且小片段cDNA提高了单个基因的代表性，增加了有差别表达基因

检出的可能性。

1、将tester、driver和controlskeletal muscle cDNA的双链cDNA用Rsal内切酶酶切，酶切体系如下:
dscDNA 43.5?L
10×RsalRestriction Buffer 5.0?L
RsaI(10units/?L) 1.5?L
总体积 50?L
2、用涡旋仪振荡混合并稍离心。

3、37℃温浴1.5h。

4、保存5?L酶切产物按SectionV.B. 分析RsaI的酶切效率。

5、加入2.5?L的20×EDTA/Glycogen混合物终止反应6、向离心管中加入50?L的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)。

7、通过涡旋振荡充分混合，在室温下14000 g离心10min。

9、然后向上清夜中加入50?L 氯仿:异戊醇(24:1)。8、仔细将上清夜转移于无菌的0.5mL 微量离心管中。

13、仔细的移去上层液体。

14、加入200?L的80%乙醇充分洗涤沉淀。

15、室温下14000 g离心5min。

16、去除上清液。

17、空气中干燥沉淀5-10min除去剩余的乙醇。

18、将沉淀溶于5.5?L的无核酸酶水中，在-20℃下保存。

19、按SectionV.B. 分析RsaI的酶切效率。

四、实验组cDNA的接头连接（drivercDNA不用连接接头）
1、取1?L性内切酶Rsal消化的cDNA，加入5?L无核酸酶水稀释。

2、准备control skeletal muscletester cDNA

a、用灭菌水将ФX174/Hae IIIControl DNA 稀释到最终浓度为150ng/mL.

b、取1?Lcontrol skeletal muscle cDNA (Step 三.19)加入5?L“a”溶液。3、准备Ligationmaster mix

无菌水	per rxn	X-rxn
	3 ?L
5×连接缓冲液	2 ?L
T4 DNA 连接酶(400 units/?L)	1 ?L
总体积	6 ?L

4、在0.5mL离心管中按顺序加入下列试剂（eachexperimental tester and controlcDNA）(用头吹打混匀)
然后将其分成均等的两份，每份2?L，分别连上接头1和接头2R，连接反应体系见表l。

表1连接反应体系
试剂 Tester1－1（?L） Tester1－2（?L）

接头1 (10 mM) -稀释的双链实验方cDNA 2

Master Mix 总体积接头2R (10mM)

5、从实验方1-1和实验方1－2中各取出2?L放入同一新的离心管中，充分混匀，作为未消减杂交的实验组对照。

6、稍离心后，将以上离心管置于16℃温浴过夜。

7、加入1?L的EDTA/Glycogen混合物终止连接反应。

8、72℃加热样品5min使连接酶灭活。

9、Brieflycentrifuge the tubes.。

10、从未消减的实验组对照管中取出1?L用无菌水稀释到1mL。

11、将样品保存于－20℃备用。

五、第一次杂交反应
注意：进行杂交反应之前，将4×Hybridizationbuffer 置于室温至少15-20min，buffer中无沉

抑制消减杂交方法通过两轮消减杂交，第一次消减杂交时，采用过量的驱动方分别与实验方1-1和实验方1-2杂交，差别表达的片段以单链的形式被大量富集，相同的片段则形成双链，消除了cDNA片段间的丰度差别，使各种单链cDNA含量均等化。第二次消减杂交，将第一次杂交后的产物混合，然后加入新制备的变性驭动方，再次退火杂交，形成两端具有不同接头(接头－1、接头－2)的杂交双链分子，并且进一步富集了目标cDNA。

1、按顺序将表2中试剂加入到0.5mL离心管中（theexperimental and skeletal muscle subtractions）。

表2第一次杂交反应体系
杂交样品
1 2
Tester1-2（?L）试剂 Tester1-1（?L）
RsaI消化的驱动方cDNA 1.5 1.5

连有接头2R 的实验方1－2cDNA 连有接头1 的实验方1－1cDNA

3、在基因扩增仪中98℃温浴样品1.5min。

4、然后在68℃条件下第一次杂交反应8h（通常在6-12h之间，不要超过12h），反应结束后立

即进行第二次杂交。

六、第二次杂交
第一次杂交的样品混合后加入新的变性的驱动方cDNA进一步富集差异表达序列，形成两端具有不同接头的差异表达序列的杂交分子。

注意：不要将第一次杂交的样品变性，迅速加入热变性drivercDNA。

1、变性驱动方cDNA的制备，将下列试剂加于无菌离心管中:

Driver cDNA	1?L
4×杂交缓冲液	1?L
无菌水	2?L

总体积 4?L
2、混匀后取1?L于0.5mL的微量离心管中，然后加入一滴矿物油3、在基因扩增仪中98℃温浴样品1.5min。

4、用移液迅速取出杂交样品2和新变性的上述体系，并将其迅速放入杂交样品1中，吹打混匀。

5、如果需要，稍离心。

6、68℃温浴过夜，进行第二次杂交反应。

7、温浴结束后，加200?L 的稀释缓冲液到样品中。

8、充分混匀后，在基因扩增仪上68℃加热7min。

9、－20℃保存备用。

七、PCR扩增
在第一次PCR反应中基于PCR的抑制效应，只有两端分别为adaptor－1、adaptor－2的cDNA

了具有差别表达的目的cDNA，极大地降低了背景。
片段才能以指数形式扩增，有效地扩增了差别表达的cDNA片段，第二次PCR 扩增进一步富集

1、准备PCR 反应模板

2、PCR反应体系见表3。

表3第一次PCR反应体系（theprimary PCR master mix） 试剂 Amountper reaction（?L）7-rxn(?L)cDNA

4、分装24?Lstep 2中的mastermix 于step1 中加入cDNA的离心管中。

5、然后加入50?L矿物油。

6、于基因扩增仪上75℃温浴反应混合物5min以补平接头，不要从基因扩增仪上移出样品。

7、立即进行PCR反应。反应程序如下:94℃30 s, 66 ℃30 s, 72 ℃1.5 min，共27个循环。8、取8?L进行分析（2.0%琼脂糖凝胶1×TAEbuffer）。

9、取3?Lstep7 的PCR反应体系，加入27?L的灭菌水（第一次PCR反应产物稀释10倍）。10、取1?Lstep 9中的PCR产物（取1?L利用巢式引物进行第二次PCR反应）。

11、准备第二次PCR反应的mastermix:
反应体系见表4。

表4第二次PCR反应体系
试剂 Amountper reaction（?L）7－r×n（?L） 1DNA

10×PCR 缓冲液 无菌水

50 × Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5 4.0
总体积 24.0 192.0
12、充分混合并稍微离心。

13、取24?Lmaster mix于step10的离心管中。

14、加入50?L矿物油。

15、立即按下述条件进行PCR反应:
10-12cycles
94℃ 30s

从第一次和第二次PCR产物中分别取8?L进行琼脂糖凝胶(1xTAE电泳缓冲液)电泳分析，观察扩增产物的大小分布
17、在-20℃下保存反应产物。

八、连接和转化
1.2.4.1连接
具体操作按照试剂盒pGEM-TVectors进行连接反应，实验采用T/A法连接，短暂离心pGEM⑨-T载体及DNA插入对照管，通过公式:
ngof vectorxkb size of insert
kbsize of vector ×insert:vectormolar ratio = ng of insert
优化连接体系，连接反应体系见表5。

表5连接反应体系
实验 阳性对照 背景对照

Pgem-T 载体（50 ng） 1?L 2 ×连接缓冲液，T4 DNA连接酶 5 ?L

对照DNA PCR 产物

最终体积 10?L 10?L 10?L注：每次使用2×连接缓冲液要充分混匀
PCR产物：载体的比率需进行梯度实验。

通过通过吹打混匀反应物，在室温下放置1h。如果需要得到最大数目的转化菌落，可置于4℃过夜。

1.2.4.2 用VectorLi gationReactions 转化感受态细胞
将盛有连接反应物的离心管离心，使所有成分汇集到管底，每一个连接反应
加2?L 的连接反应物于灭菌的1.5mL 离心管中。将-70℃冷冻的Escherichia coli DH5α高效感受态细胞在冰浴中解冻，大约5min 后通过轻弹试管使其混合。仔细转移50?L 的感受态细胞于上述的1.5mL 离心管中，轻弹使其与连接反应物混匀，冰浴20min,在42 ℃水浴中热休

克感受态细胞45-50s，不要摇动，并立即将其放于冰浴中2min，然后加950?L 处于室温的SOC

培养基于盛有转化细胞的离心管中，在37℃
摇床(150rpm)培养1.5h。每一转化培养物取100?L铺平板(两个平板LB/ampicillin/IPTG /X-Gal)。如果想得到较高数量的克隆，可在1000 g离心10min沉淀细胞，然后用200?L的SOC培养基重悬细胞沉淀，取100?L在两个培养皿上铺平板，然后反置培养皿于37'C恒温培养箱中培养过夜(16~24h )，观察菌落生长情况。